Nat Biotech综述 | 基因编辑治疗离我们还有多远？——论有效的递送方式

撰文 | Katherina

基因编辑技术可以广泛被用于治疗很多种类型的疾病，比如单基因突变引起的孟德尔遗传疾病或者更加复杂的特发性疾病等(图1)。序列特异性核酸酶技术极大地加速了基于致病基因敲除或内源突变基因修复的基因编辑治疗手段的发展。这些基因编辑治疗的手段也逐步被推广到临床中使用，然而有效的递送与运载技术在近年来被认为是决定基因编辑治疗成功的关键一环，例如用于基因治疗的腺相关病毒与慢病毒载体以及用于核酸和蛋白质递送的脂质纳米颗粒和其他非病毒类载体。

图1 基因编辑治疗手段总览

大分子递送，自基因编辑技术问世以来就一直限制着核酸治疗领域。例如，治疗单基因复发性疾病B2型血友病、腺苷脱氨酶缺乏症、2型莱伯氏先天性贫血面临的主要瓶颈的突破是成功开发出腺相关病毒(AAV)载体及逆转录病毒和慢病毒载体系统。早在1978年的时候，人们就发现反义寡核苷酸就可以在鸡胚成纤维细胞中抑制mRNA的翻译，然而姗姗来迟的递送技术使得这项基因编辑疗法直到1998年才获得美国FDA的批准。类似地，得益于为递送小干扰RNA(siRNA)而成功开发的脂质纳米粒技术，临床批准了使用RNAi治疗遗传性甲状腺素介导的淀粉样变性(hATTR)。近年来，临床上运用基因疗法，反义基因疗法，小干扰RNA(siRNA)疗法等揭示了向患者成功递送基因编辑技术的可能性。

近日，来自美国加州大学伯克利分校的David V. Schaffer教授团队和Niren Murthy教授团队合作在Nature Biotechnology在线发表题为The delivery challenge: fulfilling the promise oftherapeutic genome editing的综述文章。文章充分探讨了基因编辑技术如何与载体协同作用，以快速实现（尤其是针对血液疾病）临床前和临床应用的快速进展。此外，他们还重点指出若想充分发挥基因编辑治疗潜力而必须克服的挑战，特别是对于需要内源基因进行同源定向修复(HDR)，体内递送至肝脏，肌肉或中枢神经系统的情况。

基因编辑酶及潜在治疗机理

大部分基因编辑技术依赖DNA核酸酶靶向细胞基因组中的特定位点，例如锌指核酸酶(ZFNs), 转录激活子样效应子核酸酶(TALENs), 大范围核酸酶和CRISPR-Cas9系统。核酸酶可以以cDNA的形式进行基因表达。核酸酶的DNA结合结构域指导其在细胞基因组约20个核苷酸的靶点位处引入DNA的双链断裂，随后通过非同源末端连接(NHEJ)和同源DNA序列介导的DNA(HDR)两种修复机制修复断裂的DNA. 另一种相关的碱基编辑技术，在不造成双链DNA断裂的情况下，Cas9酶的DNA结合结构域(dCas9)与一种可以改变单一目标DNA的碱基的酶活性融合。最新开发的初级编辑系统在不引起DNA双链断裂的情况下，不仅可以修正点突变，还可以纠正小插入缺失的问题。HDR还可用于治疗特定基因功能丧失的隐性突变。例如，将编码白介素2受体γ链的cDNA敲入相应的内源基因座，从而将用具有治疗功能的cDNA控制后续转录过程，而避免了有遗传毒性的逆转录病毒基因片段的插入。

基因编辑技术的有效递送到底难在哪?

首先，一些基因编辑所需的酶的大小就超过了常用病毒基因传递载体的大小，而当我们基因编辑时涉及到HDR，供体模板会大大增加整个载体的大小。另一个面临的难题是基因组编辑工具应该仅在靶细胞中完成瞬时递送，因为长时间的活性可能会造成对脱靶核酸酶的基因毒性和对这些原核蛋白的免疫反应【1】。虽然非病毒递送可以帮助我们实现瞬时递送，但是我们依旧大力开发AAV和慢病毒用于基因替代疗法，部分原因是它们具有长期介导基因表达的能力。基因编辑技术遇到的另一项挑战是基于核酸酶的基因编辑机制，当DNA链断裂后，可能会引发一系列的遗传毒性。除此之外，基因编辑载体引入，可能会造成一些特殊的免疫反应。例如，引入非自身蛋白Cas9或者合成的gRNAs都可能在动物体内引发从头发生的免疫反应(de novo immune responses)。HDR过程所涉及的DNA供体也可能诱发先天免疫反应，从而导致细胞毒性。

由病毒介导的递送机制

现有的基因编辑技术常常使用AAV、慢病毒、腺病毒等载体(图1)。AAV具有一个4.7kb的单链线性DNA基因组，其编码两个基因：rep（介导基因组复制）和cap(编码病毒衣壳的结构蛋白。通过反式结构(in trans)将rep和cap包裹在衣壳内，可以产生一个不具备复制能力的载体，不同的衣壳能够在体内递送至不同的组织和细胞。慢病毒载体是先将 HIV-1或其他慢病毒的活性相关序列去除，然后再在这个慢病毒基因组骨架中引入实验所需要的目标基因的序列和表达结构，并将之制备成约10kb大小载体。慢病毒可以用不同的包膜蛋白来定向递送的方向性。腺病毒载体是双链线性DNA(dsDNA)病毒。在载体制备过程中，去除特定的病毒元件(如E1)，为转基因的插入腾出了空间。

体外递送

首次进行基因编辑的人类临床试验是基于T细胞的一种细胞疗法，该T细胞在体外已用含有针对CCR5的ZFN的腺病毒载体转导。HIV将其作为进入细胞的受体，从而产生不会被HIV感染的T细胞【2】。自体移植后，抗HIV小分子治疗中断后，CCR5敲除的T细胞比正常T细胞存活得更好，并且在大多数受试者中，HIV mRNA的循环水平明显下降。AAV也已用于体外递送，差别在于,AAV在不存在核酸酶的情况下使用DNA作为供体。

肝脏递送

上述提到过的HDR介导的将cDNA整合到高度表达的内源基因座上产生很强的转基因表达，这为治疗血友病提供了思路。在ZFN介导的相应cDNA敲入强表达白蛋白基因座后，肝脏可以分泌高水平的VIII因子和IX因子。最近，Cas9已被用于肝脏基因组编辑。但是考虑到SpCas9的大小，需要分成两个单独的载体：一个编码核酸酶，一个编码gRNA，有时还需要供体模板【3】。一些较短的Cas9变体，例如SaCas9能够在单个AAV载体中递送核酸酶和gRNA。除此之外，腺病毒也可被用于递送Cas9。腺病毒载体虽然具有免疫原性，但其能在单个载体中容纳核酸酶和供体模板。

神经系统递送

中枢神经系统是基因编辑治疗的另一个重要靶标，尤其是通过病理等位基因的敲除为许多常染色体显性遗传等单基因疾病带来了治疗的曙光。在最近的一项工作中，使用了AAV双载体，一个病毒载体表达SpCas9，另一个表达gRNA，从而敲除突变的亨廷顿蛋白。在亨廷顿舞蹈病的小鼠模型中，这种基因编辑疗法可降低神经毒性和运动功能障碍【4】。

视网膜递送

视网膜是另一个有望成功应用基因编辑治疗的领域，特别是考虑到许多单基因视网膜疾病具有良好的生物学特性、动物学模型的可用性、可用的近期临床终点以及FDA批准建立的LCA2基因治疗调控路径。10型莱伯氏先天性黑内障普遍存在的突变是由于一个隐秘的剪切位点破坏了CEP290蛋白的表达。一项已经进入I期临床试验的治疗手段是使用双载体AAV5系统来传递SpCas9和两种gRNAs，来切除基因组上的突变【5】。

肌肉组织递送

有多项出色的研究在载体AAV8/AAV9中使用双重编码系统：编码SpCas9和其他两个gRNAs，来切除含有过早终止密码子的肌营养不良蛋白外显子，从而达到治疗杜氏肌营养不良症(DMD)。由此产生的外显子跳读可以恢复肌营养不良蛋白的正常表达，从而显著增强了骨骼肌的功能【6,7】。

非病毒介导的递送机制

非病毒介导的递送尽管基因组编辑酶的效率不及病毒递送的方法，但核酸酶活性具有瞬时性优势。更重要的是，与病毒载体不同，非病毒载体（例如，基于脂质的纳米颗粒）可以重复给药，从而提高基因编辑成功的机会。

总而言之，尽管基因编辑治疗领域近年来取得了很多突破和进展，但是在完全实现基因编辑临床治疗之前，需要解决包括如何实现高递送效率，如何实现高容量载体并且实现高效递送，以及如何提供瞬时高表达的载体等一系列问题。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-020-0565-5

制版人：老翅膀

参考文献

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1.Charlesworth, C. T. et al. Identification of preexisting adaptive immunity toCas9 proteins in humans. Nat. Med. 25, 249–254 (2019).
2. Tebas, P. etal. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected withHIV. N. Engl. J. Med. 370, 01–910 (2014).3. Song, C. Q. et al. In vivo genome editing partially restores alpha1-antitrypsin in a murinemodel of AAT deficiency. Hum. Gene Ther. 29, 853–860 (2018).4. Yang, S. etal. CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse modelof Huntington’s disease. J. Clin. Invest. 127, 2719–2724 (2017).5. Ruan, G. X.et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing as a therapeutic approach for Lebercongenital amaurosis 10. Mol. Ther. 25, 331–341 (2017).6. Nelson, C.E. et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model ofDuchenne muscular dystrophy. Science 351, 403–407 (2016).7. Long, C. etal. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in amouse model of muscular dystrophy. Science 351, 400–403 (2016)